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Avivasysbio  ELISA 常見(jiàn)問(wèn)題

你能推薦我的樣品稀釋嗎？

我可以使用該套件多少次？

我懷疑我的樣本可能含有干擾因素（溶血/脂血/血液等）。這將如何影響檢測(cè)？

為什么標(biāo)準(zhǔn)瓶中的顆粒大小不同？

我應(yīng)該如何裂解我的細(xì)胞/組織？

我需要多少樣品？

我的樣品測(cè)量值隨著進(jìn)一步稀釋而增加？

我的樣品測(cè)量值低于空白？

我的空白很高，我的標(biāo)準(zhǔn)很低？

我可以使用血液樣本嗎？

Kit 可以分開(kāi)運(yùn)行嗎？

低標(biāo)準(zhǔn)曲線低于空白或空白太高

為什么這個(gè)試劑盒不能檢測(cè)我購(gòu)買(mǎi)的另一種市售重組蛋白？

競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)：0 (ng/mL) 孔與空白孔

ELISA 計(jì)算說(shuō)明

我應(yīng)該使用多少個(gè)細(xì)胞來(lái)制備細(xì)胞裂解物樣本？

抗凝劑（又名，“檸檬酸鹽對(duì)我的檢測(cè)有用嗎？”）

檢測(cè) xxx（血漿、血清等）中外泌體上的跨膜蛋白。是否需要提取蛋白質(zhì)？

樣品類型的長(zhǎng)期儲(chǔ)存：

標(biāo)準(zhǔn)曲線+空白有效，樣品類型為陰性。

1. 你能推薦我的樣品稀釋嗎？

由于不同用戶和樣品類型的蛋白質(zhì)表達(dá)水平范圍很大，我們不建議針對(duì)每種應(yīng)用進(jìn)行特定稀釋。

我們建議始終使用試劑盒中定的稀釋劑（通常是樣品稀釋劑或標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑）以至少 1:2 的比例稀釋。

*佳稀釋度是樣品信號(hào)強(qiáng)度落在動(dòng)態(tài)范圍中間的位置，應(yīng)由以下任一決定：

在執(zhí)行完整實(shí)驗(yàn)之前，測(cè)試您的隊(duì)列中連續(xù)稀釋的代表性樣本。或者，如果樣本量有限，也可以使用相同的方法使用由幾個(gè)樣本組成的小池。

-或者-

有關(guān)預(yù)期濃度，請(qǐng)參閱已發(fā)表的文獻(xiàn)，并根據(jù)試劑盒的預(yù)期動(dòng)態(tài)范圍得出*佳稀釋水平。

2. 我可以使用該套件多少次？

該板是 12 x 8 孔條。將未使用的條帶放回鋁箔袋中。

兩次運(yùn)行有兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品瓶。不要儲(chǔ)存重構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)供以后使用。

只準(zhǔn)備立即運(yùn)行所需的檢測(cè)試劑。

3. 我懷疑我的樣本可能含有干擾因素（溶血/脂血/血液等）。這將如何影響檢測(cè)？

干擾因素會(huì)影響試劑盒的生物成分（捕獲/檢測(cè)抗體），并可能影響吸光度讀數(shù)。為了減輕可疑的干擾因素：

稀釋是減輕干擾因素的*佳方法。根據(jù)試劑盒的動(dòng)態(tài)范圍，在目標(biāo)分析物濃度允許的范圍內(nèi)，用定的試劑盒稀釋劑稀釋樣品。

在 4°C 下以 10,000 rpm 離心樣品 10 分鐘可以去除一些干擾因素。

異嗜性或動(dòng)物結(jié)合抗體必須使用特定的抗干擾緩沖液處理。

4. 為什么標(biāo)準(zhǔn)瓶中的顆粒大小不一？

這是凍干的正常現(xiàn)象。顆粒可能看起來(lái)小而致密或蓬松和絮狀。這是由于在干燥過(guò)程中整個(gè)凍干室的溫度和壓力變化非常小。這不會(huì)影響標(biāo)準(zhǔn)，只要它們被*重組。

5. 我應(yīng)該如何裂解我的細(xì)胞/組織？

推薦的機(jī)械裂解方法包含在協(xié)議中。我們建議使用冷凍/解凍或超聲波進(jìn)行機(jī)械裂解以裂解細(xì)胞。細(xì)胞應(yīng)在 PBS 緩沖液中裂解。

如果出現(xiàn)以下情況，化學(xué)裂解是可以接受的：

任何清潔劑、有機(jī)溶劑或還原劑的最終濃度均小于 0.01%。

您感興趣的靶標(biāo)的濃度足夠高，以至于在將裂解緩沖液*稀釋至上述檢測(cè)可接受的濃度時(shí)，可以根據(jù)試劑盒的動(dòng)態(tài)范圍對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。

在這一步，請(qǐng)檢查組織/細(xì)胞系的預(yù)期 RNA-seq 數(shù)據(jù)，以及蛋白質(zhì)在 Uniprot 上的細(xì)胞中表達(dá)的位置，以確保它有意義。

6. 我需要多少樣品？

試劑盒需要 100 uL，因此如果最小稀釋度為 1:2，則需要 50 uL。

7. 我的樣品測(cè)量值隨著進(jìn)一步稀釋而增加？

這可能是幾個(gè)問(wèn)題。通常，這是由于樣品中的干擾因素造成的。通常這發(fā)生在血清或血漿中，而不是細(xì)胞/組織/超級(jí)細(xì)胞。*佳樣品稀釋水平必須通過(guò)連續(xù)稀釋來(lái)確定。如果樣品測(cè)量值顯示從標(biāo)準(zhǔn)曲線的反向計(jì)算線性回歸的線性測(cè)量值跨越 2 或 3 次稀釋，則為*佳稀釋點(diǎn)。

在 ELISA 中，更多的稀釋總是更好，因?yàn)樗梢詼p輕任何潛在的測(cè)定干擾并提供更準(zhǔn)確的測(cè)量。

8. 我的樣品測(cè)量值低于空白？

如果樣品表達(dá)的目標(biāo)分析物濃度低于測(cè)定的動(dòng)態(tài)范圍，這是正常的。空白測(cè)量值更高，因?yàn)闃悠分袥](méi)有任何東西，導(dǎo)致非特異性結(jié)合。在某些情況下，樣品中的少量基質(zhì)實(shí)際上會(huì)減少非特異性結(jié)合。

9.我的空白很高，我的標(biāo)準(zhǔn)很低？

這可能是一個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題，無(wú)論是用戶故障還是套件故障。

10. 我可以使用血液樣本嗎？

您可以將此試劑盒與全血一起使用，但我不推薦它。全血有很多干擾因素，可能會(huì)影響測(cè)試結(jié)果。如果您有全血，我建議將其處理成血清或血漿以獲得更好/一致的結(jié)果。

11. Kit 可以分開(kāi)運(yùn)行嗎？

我會(huì)推薦：

1. 在上課前準(zhǔn)備和稀釋您的樣品。

2. 在上課前準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋液。最好在檢測(cè)前直接準(zhǔn)備這些和樣品，但它們可能會(huì)在 30 分鐘左右就可以了。

檢測(cè)應(yīng)在制備試劑后 4 小時(shí)內(nèi)完成。檢測(cè)器和偶聯(lián)物稀釋液可以在前一步孵育期間使用前制備。

請(qǐng)注意，如果需要，您可以稍微調(diào)整樣品/標(biāo)準(zhǔn)孵育步驟，而不會(huì)過(guò)多地?fù)p害靈敏度。該測(cè)定將運(yùn)行相同，但只會(huì)提供稍低的整體信號(hào)水平。

12. 低標(biāo)準(zhǔn)曲線低于空白或空白過(guò)高

基于觀察到低標(biāo)準(zhǔn)曲線低于空白，我懷疑這是以下一項(xiàng)或多項(xiàng)：

1. 洗孔不充分。

2. 出現(xiàn)移液錯(cuò)誤。

3. 標(biāo)準(zhǔn)稀釋錯(cuò)誤。

4. 試劑制備錯(cuò)誤。

13. 為什么這個(gè)試劑盒不能檢測(cè)我購(gòu)買(mǎi)的另一種市售重組蛋白？

不是所有的市售重組蛋白都能被檢測(cè)到。需要考慮重組蛋白的抗體檢測(cè)存在固有的困難。重組蛋白的折疊可能不同于內(nèi)源天然形式，并且可能阻止抗體接近表位。標(biāo)記蛋白尤其如此。

標(biāo)準(zhǔn)氨基酸序列可能與您的陽(yáng)性對(duì)照序列和表達(dá)系統(tǒng)不同。

即使您使用相同長(zhǎng)度的重組蛋白，不同的表達(dá)系統(tǒng)、不同的糖基化和不同的蛋白質(zhì)折疊也會(huì)改變抗體結(jié)合。這可能就是為什么此試劑盒中的抗體無(wú)法檢測(cè)您購(gòu)買(mǎi)的重組 NEDD9 蛋白的原因。

14. 競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)：0 (ng/mL) 孔與空白孔

對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定，0 ng/mL 的孔可檢測(cè)抗原--復(fù)合物與試劑盒反應(yīng)的信號(hào)量，而不會(huì)與您的樣品/標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)。由于該孔僅包含抗原--復(fù)合物，因此它與 TMB 的反應(yīng)強(qiáng)，因此具有最深的藍(lán)色陰影。0 ng/mL 孔的目的是讓檢測(cè)中的所有試劑和緩沖液都在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的環(huán)境中，這樣您就可以確認(rèn)您的標(biāo)準(zhǔn)品和抗原--復(fù)合物具有競(jìng)爭(zhēng)力。

另一方面，競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定的空白將是一個(gè)沒(méi)有樣品且沒(méi)有抗原--復(fù)合物的孔（手冊(cè)中的步驟 10.4），它將檢測(cè)試劑盒的非特異性結(jié)合，供您從中減去。它應(yīng)該只包含樣品稀釋劑。

15. ELISA 計(jì)算說(shuō)明

可以通過(guò)幾種不同的方式通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸得出樣品測(cè)量值。這真的取決于你有什么軟件。

冪指數(shù)函數(shù)或線性回歸可以正常工作，對(duì)于只有 Excel 等軟件的用戶來(lái)說(shuō)通常是簡(jiǎn)單的。如果您的標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)較直，則可能不需要 4-P（四參數(shù)邏輯 (4-PL)）。

如果曲線是 S 型曲線，如果您有一些軟件，我們總是建議進(jìn)行 4-P 擬合。如果您有可以使用 4 參數(shù) S 型曲線擬合模型的軟件（例如 PRISM），這通常對(duì)許多 ELISA 用戶來(lái)說(shuō)更準(zhǔn)確，但并不是每個(gè)人都具備這種軟件功能。

16. 我應(yīng)該使用多少個(gè)細(xì)胞來(lái)制備細(xì)胞裂解物樣本？

這將取決于客戶研究的目標(biāo)水平。通常以 1x108cell/ml 裂解細(xì)胞會(huì)起作用。

17. 抗凝劑（又名，“檸檬酸鹽對(duì)我的檢測(cè)有效嗎？）

對(duì)于我們的試劑盒，我們推薦肝素和 EDTA 作為抗凝劑，因?yàn)樗鼈兺ǔＴ诖蠖鄶?shù)情況下產(chǎn)生更好的結(jié)果。

以下是關(guān)于用于 ELISA 樣品處理的抗凝劑的一般優(yōu)缺點(diǎn)列表：

抗凝物    臨    騙局

檸檬酸鹽 適用于大多數(shù)凝血測(cè)試，可保護(hù)血因子   溶解性差，抗凝作用弱。

乙二胺四乙酸 對(duì)紅細(xì)胞和白細(xì)胞的形態(tài)影響不大      對(duì)血小板聚集有影響。不適合檢測(cè)凝血和血小板功能相關(guān)實(shí)驗(yàn)

肝素 抗凝能力強(qiáng)，不影響血細(xì)胞體積。不易發(fā)生溶血。在高溫下保持穩(wěn)定性 導(dǎo)致白細(xì)胞聚集。肝素抗凝樣品應(yīng)盡快使用，否則很快會(huì)再次凝固

如果有機(jī)會(huì)，建議使用不同的抗凝劑。

18. xxx（血漿、血清等）外泌體上跨膜蛋白的檢測(cè)。是否需要提取蛋白質(zhì)？

我們推薦以下蛋白質(zhì)提取緩沖液：

英杰華 SKU   云克隆 SKU   產(chǎn)品名稱

液晶顯示器00001  IS007-裂解緩沖液 1     裂解緩沖液：膜蛋白

液晶顯示器00002  IS007-裂解緩沖液 2     裂解緩沖液：細(xì)胞質(zhì)蛋白（結(jié)構(gòu)）

液晶顯示器00003  IS007-裂解緩沖液 3     裂解緩沖液：細(xì)胞質(zhì)蛋白（核基質(zhì)、膜）

OLCD00004   IS007-裂解緩沖液 4     裂解緩沖液：核基質(zhì)蛋白、核內(nèi)體、其他細(xì)胞器

19、樣品種類的長(zhǎng)期保存：

樣品應(yīng)分裝在 -80oC 下。蛋白質(zhì)變質(zhì)可能/可能發(fā)生，但這*取決于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。我們的實(shí)驗(yàn)室使用新鮮樣品進(jìn)行驗(yàn)證，但尚未進(jìn)行蛋白質(zhì)穩(wěn)定性測(cè)試——如果可能，我們建議使用新鮮樣品進(jìn)行檢測(cè)。

20. 標(biāo)準(zhǔn)曲線+空白工作，樣品類型為陰性。

一般來(lái)說(shuō)，如果是血清/血漿，可能是由干擾（基質(zhì)效應(yīng)）引起的。如果樣品類型是細(xì)胞裂解物/組織勻漿，可能是由于使用了去污劑/化學(xué)裂解物。我們建議機(jī)械裂解是安全的。

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