Ambeed報告結果

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Ambeed結果和討論自旋標記的合成及其插入依替非巴肽中除了最后一步外，目標化合物4和5的合成是根據文獻(方案2)58完成的。經過雙重 MANNICH 型反應后，所得中間體直接用于以4-甲基噻吩為親核取代反應的后續重結晶中，產生63% 的聯合收率的雙硫醚7。H2O2在乙酸中氧化7后，通過1-乙基 -3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)介導的酰胺偶聯反應將雙磺酸8與4-氨基 TEMPO 偶聯。經柱色譜法凈化后，產物成為雙砜4和烯丙基砜5不可分離的混合物。考慮到這樣一個事實，即在插層化學反應條件下，4被轉化為活性的 MICHAEL 受體5，沒有試圖分離這兩種化合物。成功地制備了目標化合物混合物4/5，然后將自旋標記引入到依非巴肽的二硫橋中。這項工作需要兩個步驟，詳見計劃3。計劃3 第一1被二硫蘇糖醇(DTT)還原以打開二硫鍵59，產生雙硫醇2。經半制備型高效液相色譜純化后，用于后續的插層反應。為此，在烯丙基砜5中加入2，該烯丙基砜5是由其與雙砜4的混合物通過溫和堿處理制備的。預期的雙重 MICHAEL 反應在半制備高效液相色譜法之后按預期發生，以12% 的收率遞送最終產物3。自旋標簽插入 eptifibatide 的證明自旋標簽的共價插入是由電噴霧離子法質譜法質譜(ESI-MS)和高效液相色譜(HPLC)證實的。插入過程可以通過比較每個步驟的 HPLC 痕跡來完成(圖1) ，并且在產物分離后通過自旋標記化合物3的質譜來驗證(圖2)。圖1 自旋標簽混合物的 HPLC 痕跡顯示雙砜4(tR = 18.3 min)和烯丙基砜5(tR = 16.1 min)的不可分離化合物(圖2d)。通過 HPLC-MS (ESI 圖9)驗證了雙砜基自旋標記及其活化物質的共存。通過比較顯示1與 tR = 7.2分鐘，還原2與 tR = 7.9分鐘和標記3與 tR = 10.7分鐘的 HPLC 痕跡，可以明確地監測插層過程。(圖1a-c)。為了確認在 tR = 10.7 min 時信號分配為標記的3，記錄并模擬了 ESI-MS 光譜(圖2)。正如預期的3，觀察到的1175.5 m/z 和588.3 m/z 的質量清楚地表明自旋標記的依非巴肽分子質量[ M + 1H ] + 和[ M + 2H ]2 + 。由于單一和雙重附著的自旋標簽的質量相等于1175.5 m/z，所以自旋標簽與兩個巰基的依非巴肽的成功結合不能用質譜法來確定。由于這個原因，游離硫醇基團的量由 Ellman 試驗60,61,62確定，使用二硫蘇糖醇(DTT)作為標準和 Ellman 試劑(5,5’-二硫-雙(2-硝基苯甲酸) ，DTNB)。DTNB 與游離巰基反應生成混合的二硫化物和2-硝基 -5-硫代苯甲酸(TNB)(上圖3)。在這個反應中，DTNB 的目標是一個自由巰基的共軛堿(R-S -)。在412 nm60,61,62時，摩爾消光系數為14.150 M-1 cm-1。TNB 的滅絕不受 pH 值在7.6至8之間變化的影響。巰基可以通過使用已知濃度的巰基如二硫蘇糖醇(DTT)來估計樣品中的巰基，檢測其每 UV-Vis 的吸光度(圖3a) ，導致校準曲線(圖3b)。用二硫蘇糖醇(DTT)還原 Ellman 試劑(DTNB)(上圖)。(a)二硫蘇糖醇(DTT)濃度依賴的紫外光譜和依替非巴肽在 Ellman 試劑(DTNB)存在下的紫外光譜。(b)在與 Ellman 試劑(DTNB)還原反應后，用已知濃度的二硫蘇糖醇(DTT)在412nm 處校正紫外光的吸光度曲線。Ellman 的實驗表明，在 pH 8時，自旋標記的依替非巴肽通過附著在兩個巰基上，由至少90% 完整插入的自旋標記組成。由此得到的硫醇濃度(見表1)與使用先前公布的硫醇群的校準曲線得到的濃度非常一致[60,61,62]。表1根據文獻60,61,62，基于圖3b 所示的校準曲線或通過利用 TNB (2-硝基 -5-硫代苯甲酸)的消光系數，18μM 自旋標記的依替非巴肽的硫醇濃度。總之，我們成功地合成了基于雙砜的自旋標簽4及其反應性消除產物5的混合物，并且我們成功地應用該混合物通過將標簽選擇性插入到其二硫鍵中來標記環七肽。插入后自旋標記活性的證據隨著標記的3在手，我們接下來測量 EPR 光譜，以驗證其自由基特征作為預期的 DNP 測量的先決條件(圖4)。(a)自旋標記的依替非巴肽3(藍色) ，(b)雙砜基自旋標記4(橙色)和(c) TEMPO 作為參考(黑色)的 EPR 光譜。注: 光譜歸一化的最大強度(左側)。光譜顯示沒有標準化(右側)。所有樣品的實驗條件相同。樣品在293k 的 DMSO 濃度為1mM 時測量。全尺寸圖像標記的依替非巴肽3，自旋標簽4/5和4-氨基-TEMPO 參考的 EPR 光譜顯示由不成對電子自旋和14N 氮(S = 1)之間的超精細相互作用引起的預期三重態，因為它是典型的氮氧化物自由基。由于使用這些實驗對信號進行絕對量化是不可行的，我們通過光譜的雙重積分進行了半定量分析。為此，我們比較了 TEMPO、雙砜自旋標記和自旋標記的依非巴肽的 EPR 譜線的絕對積分。以 TEMPO 為參照，結果表明雙砜自旋標記的相對活性為90% ，自旋標記的依非巴肽的相對活性為79% 。基于這些結果，我們接下來研究了自旋標記的3在典型的 DNP 溶劑混合物甘油 -d8/D2O/H2O = 60/30/10(v/v)中的 DNP 活性。為了確保自旋標簽在這種溶劑混合物中的穩定性，進行了 HPLC 分析。標記的依替非巴肽的 HPLC 痕量在其整齊的形式和在上述溶劑混合物(見 ESI 圖14)的比較顯示沒有顯著差異，從而證明其在測量條件下的穩定性。為了檢查 DNP 應用的偏振轉移效率，記錄了1H MAS NMR (圖5a)和1H13C CP MAS NMR (圖5b)光譜。通過1H MAS 光譜(圖5a)與微波輻照(MW On)和無微波輻照(MW Off)的比較，觀察到微波輻照下的信號比“ MW Off"光譜增強了14倍。圖5圖51H (a)和1H13C CP MAS NMR (b)15mM 自旋標記的依非巴肽3在具有(MW on)和不具有(MW off)微波輻照的甘油 -d8/D2O/H2O 基質中的譜在9.4 Tesla 以8kHz 的自旋速率測量。在13C 光譜中，60.7 ppm 和70.5 ppm 處的兩個信號表示甘油，0 ppm 處的小信號歸因于標有 # 的硅塞，用于緊密關閉核磁共振轉子中的液體。星號表示13C 光譜中甘油的自旋邊帶和1H 光譜中水的自旋邊帶。在這個樣品的1H13C CP MAS NMR 譜中，甘油碳原子的信號在60.7和70.5 ppm 處有更高的信號增強。兩個信號都增強了19倍(圖5b) ，相當于節省了361倍的時間。這意味著在固態 DNP 分析中使用這種自旋標記將比標準固態核磁共振測量時間從一年減少到一天。1H 和1H13C CP MAS NMR 增強之間的明顯差異最可能與來自未極化的質子的固有背景信號有關[63]。的信號在光譜中未被檢測到，最可能是由于其濃度低(約15mM) ，其比 DNP 基質中甘油 -d8(8.2 M)的濃度小約550倍。此外，由于依替非巴肽的尺寸相對較小，由于信號漂白，在光譜中只能看到甘油的13C 核。這種現象已被詳細描述用于 DNP 核磁共振實驗中的其他硝基自由基系統64,65以及蛋白質系統中的自由基自旋標記66。為了強調這些假設，需要對依替非巴肽進行同位素標記，這超出了這項工作的范圍。結論本文合成了一種新的位點選擇性雙砜自旋標記，并證明了其適用于將 TEMPO 衍生的自旋標記插入生物活性分子的二硫鍵中。合成了雙砜4及其 β-消除產物5的雙組分混合物，其中雙組分都可以參與標記反應，因為在反應條件下消除產生了活性 MICHAEL 受體5。作為預期插入過程的可行性的例子，將自旋標簽插入依非巴肽3的二硫鍵中，依非巴肽3是一種合成的環七肽，來源于在響尾蛇纖毛蟲巴布林的毒液中發現的去整合素蛋白。EPR 分析表明，自旋標記物與依替非巴肽的二硫鍵結合后仍能保持其活性。考慮到將自旋標記插入二硫鍵(DTT 還原)所需的還原條件，這是一個重要的結果67。最后，成功地進行了固態 DNP NMR 測量，導致來自基質的質子的 DNP 信號增強14和甘油的碳的 DNP 信號增強19，這對應于高達361的時間節省因子。雖然這里使用的低分子量3證明了將自旋標記插入 S-S 鍵的主要可行性，但只有基質的超極化13C- 核在13C-NMR 譜中被解析，我們假設觀察較大的結合伴侶的細胞核如活化的血小板糖蛋白 IIb/IIIa 受體在結合研究中66,68。這些令人鼓舞的結果為開發和應用強大的工具鋪平了道路，用于將位點選擇性自由基自旋標記引入生物分子和生物固體，而不損害其構象完整性，用于采用固態 DNP 或* EPR 技術的結構研究。此外，應該可以使用這種或類似的化合物進行超感官溶解二硝基酚的應用，以研究藥代動力學作為一種非侵入性的方法。除非另有說明，所有材料均購自商業供應商(Fisher Scientific，Acros Organics，Merck，ABCR，Alfa 棉花糖) ，并且未經進一步純化而使用。Eptifibatide (CAS: 188627-80-7)購自 Ambeed 公司。以高效液相色譜級別購買溶劑，并以甲苯共沸蒸餾干燥羥基苯并三唑。用于核磁共振波譜的氘化溶劑購自 Sigma-Aldrich 公司。方案4收集所有合成化合物。使用硅膠(SilG/UV 252，平板厚度: 0.25 mm)由 Macherey-Nagel GmbH & Co. 進行薄層色譜。KG.通過 UV 熒光和用 KMnO4猝滅或氧化來實現可視化。表征已經使用 Bruker 300MHz Avance III NMR 譜儀或300MHz Avance II NMR 譜儀(1H-NMR 300.16 MHz，13C NMR 125.78 MHz)在 TU Darmstadt 的服務部門進行了液體 NMR 溶液狀態 NMR 測量。化學位移以 ppm 表示。采用溶劑峰的化學位移作為內標。反相高效液相色譜法(RP-HPLC)反相高效液相色譜法(RP-HPLC)用于分析目的，使用由配備 Waters 2998 PDA 檢測器的 Waters Alliance e2695組成的 Waters HPLC 裝置進行。檢測波長的選擇取決于214,254,280和301納米之間的分析物。高效液相色譜系統的洗脫體系包括洗脫劑 A (0.1% aq。TFA)和洗脫液 B (含0.1% TFA 的99.9% 乙腈)。除非另有說明，否則以2ml/min 的流速進行高效液相色譜分析，在洗脫液 A 中洗脫液 B 的20% 至80% 的洗脫液梯度超過20分鐘。使用來自 Macherey 的 Nucleosil 100-5c18柱(5μm，100?)進行分析。在 Knauer Multokrom RP18柱20 × 250mm (5μm，100?)上進行肽的制備純化，使用9mL/min 的流速和在60分鐘的過程中不含 TFA 的乙腈梯度從0到50% 。Ellman’s testEllman’s 檢驗根據文獻60,61,62量化游離巰基。DTNB (5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸，Ellman 試劑)與游離巰基反應生成混合二硫化物和2-硝基 -5-硫代苯甲酸(TNB)。因此可以在412nm 處檢測到 TNB 的吸光度。在這方面，二硫蘇糖醇(DTT)被用作校準的標準。將8mg DTNB 溶于1ml DMSO 中，制備20mM DTNB 原液。用0.1 m 二水合磷酸一氫鈉(pH8.0)將原液稀釋100倍，得到0.2 mM 二硝基*工作溶液。通過向每個1ml 離心管中加入510μl 0.2 mM DTNB 工作溶液，加入50μl 在 DMSO 中具有已知濃度的樣品并通過渦旋混合來實現 DTNB 的還原反應。將50μlDMSO 加入到510μl0.1 mM DTNB 工作溶液中進行空白處理。室溫培養時間約為10分鐘。用 J & M Analytik AG TIDAS S 光譜儀在412nm 處對空白樣品進行吸光度測定。電噴霧質譜法(ESI-MS)電噴霧電離(電子噴霧電離)質譜記錄與布魯克先生-LC 質譜儀在德國達姆施塔特工業大學服務部。所有樣本的電子順磁共振電子自旋共振(ePR)光譜均在一臺配備了一個 a TC h03溫度控制器和一個9.43 GHz 的長方形 TE102諧振器的電子順磁共振微型顯微鏡 MS-400(Magnettech，Germany)上測量。記錄所有 EPR 光譜，調制振幅為0.1 mT，調制頻率為100kHz。在24dB 的微波衰減下，獲得了尾數增益為1和指數增益為1的光譜。測量在298K 下進行。用337mT 的中心 B0磁場掃描14mT 的磁場范圍，掃描時間為60s，獲得2048個點。動態核極化(DNP) NMR 實驗所有的測量都在 Bruker Avance NEO 400MHz DNP 光譜儀上進行，該光譜儀配備有4.8 T Bruker 回旋管系統，以263GHz 的頻率產生微波(MW)。在1H/13C/15N 配置中使用3.2 mm 低溫三重共振探針，導致1H 的中心頻率為400.2 MHz，13C 的中心頻率為100.6 MHz。樣品溫度為97 K 或107 K 的測量沒有或與微波輻照，分別名義上注意到。溫度的差異是由于在一個固定的最大冷卻功率的兆瓦輻照造成的。所有1H 和1H →13C CP MAS 均采用8kHz 的 MAS 旋轉頻率，1H MAS 測量采用 π/2激發脈沖2.3 μs，循環延遲5s4掃描。通過將硅塞信號設置為0 ppm，參考 TMS 的光譜，記錄了接觸時間為2ms 的1H →13C CP MAS 實驗，設置了18.2 s 的循環延遲，并進行了8次掃描。循環延遲設置為1.3倍 T1的質子，這是測量與 T1建立的實驗使用飽和恢復脈沖序列。13C 光譜參考相對于信號的硅插頭(- 硅-甲烷0 ppm)。為了解耦的質子脊柱-64脈沖序列被使用69。

雙砜基自旋標記的合成雙硫醚的合成(文獻48)5.66 g (34.48 mmol，1.00 eq。)4-乙酰苯甲酸，5.01克(167.0 mmol，4.84當量)多聚甲醛和13.62克(167.0 mmol，4.84 eq)鹽酸二甲胺在異丙醇中稀釋，加熱回流24小時，冷卻后出現沉淀，通過加入水分解。加入8.56克(68.95 mmol，2.00當量)后4-硫醇和 Ar 氣氛的應用。反應再加熱回流24小時，冷卻至室溫后過濾沉淀固體。固體用水沖洗，干燥并在甲醇中重結晶得到產品為無色固體。產量9.47克(63%) ;1H-NMR (300MHz，CDCl3,301.2 K) : δ (ppm) = 11.11(bs，1-COOH) ，8.06(d，3J = 8.3 Hz，2-H10) ，7.63(d，3J = 8.3 Hz，2-H11) ，7.15(d，3 J = 7.98 Hz，4-H4)，7.06(d，7.98 Hz，4-H3) ,3.83(p，1-H7) ，3.22(m，4-H6) ，2.36(s，6-H1) ;13C-NMR (75MHz，CDCl3,301.2 K) : δ (ppm) = 200.0(8-C) ，170.9(13-C) ，140.5(2-C) ，137.2(9-C) ，132.8(12-C) ，131.5(3-C) ，131.0(5-C)，130.2(11-C) ，129.8(4-C) ，128.3(10-C) ，45.9(7-C) ，36.3(6-C) ，21.1(1-C) ;EA (C25H24O3S2) : 計算值: C: 68.78 H: 5.54 N: 0.00，測量值: C: 68.95 H: 5.47 N: 0.00;議員。: 攝氏137.5度至140.0度(計劃4)。

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