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BNIP3調節惡性周邊神經腱鞘瘤細胞中的 AT101[(-)-棉酚]誘導的死亡

更正2015年8月27日: Kaza N，Kohli L，Graham CD，Klocke BJ，Carroll SL，et al。(2015)更正: BNIP3調節 AT101[(-)-棉酚]誘導的惡性周邊神經腱鞘瘤細胞死亡。PLOS ONE 10(8) :

惡性外周神經鞘腫瘤(MPNST)是一種侵襲性雪旺細胞來源的肉瘤，是導致神經纖維瘤(NF1)患者死亡的主要原因。目前的治療方法在很大程度上是無效的，導致 MPNST 復發率高，5年患者生存率差。這就需要對 MPNST 患者進行替代化方案的探索。本研究旨在評估 BH3-模擬物 AT101[(-)-棉酚]在體外對 MPNST 細胞的細胞毒作用，并鑒定 AT101誘導的 MPNST 細胞死亡的關鍵調節因子。我們發現 AT101引起半胱天冬酶非依賴性，非凋亡性 MPNST 細胞死亡，伴隨著自噬，并通過 HIF-1α 誘導的非典型 BH3-only 蛋白 BNIP3的表達介導。這些作用是由細胞內鐵螯合介導的，這是以前未報道的 AT101細胞毒性機制。

引文: Kaza N，Kohli L，Graham CD，Klocke BJ，Carroll SL，Roth KA (2014) BNIP3調節 AT101[(-)-棉酚]誘導的惡性周邊神經腱鞘瘤細胞死亡。PLoS ONE 9(5) : e96733. 斯賓塞 · 吉布森，曼尼托巴大學，加拿大收到: 2013年12月19日; 接受: 2014年4月10日; 發表: 2014年5月13日版權: 2014 Kaza et al。這是一篇開放獲取的文章，根據知識共享的署名許可條款分發，允許在任何媒體上不受限制地使用、分發和復制，只要原作者和來源被署名。資金: 這項工作得到了國家癌癥研究所贈款 CA134773(KAR，SLC)和 CA122804(SLC) ，全國神經紊亂和中風研究院贈款 NS41962(KAR)和國防部贈款 X81XWH-09-1-0086和 W81XWH-12-1-0164(SLC)的支持。資助者在研究設計、數據收集和分析、決定發表或準備稿件方面沒有任何作用。相互競爭的利益: 作者宣稱不存在相互競爭的利益

惡性外周神經鞘瘤(MPNST)是高度侵襲性的雪旺細胞來源的肉瘤，經常發生于良性叢狀神經纖維瘤[1]。大約一半的多發性神經營養不良癥是零星出現的，其余的發生在神經纖維瘤(NF1)患者中。NF1是影響人類神經系統的最常見的遺傳性常染色體顯性遺傳病，在3500名新生兒中發生1例，NF1患者中有8-13% 在其一生中發展為 MPNST [3]。目前治療 MPNST 的標準是手術，然而，完整的手術切除往往是不可能的，MPNST 侵襲鄰近組織和轉移[4]。放治療抑制局部 MPNST 復發，但不增加患者生存率。化同樣無效。因此，MPNST 是 NF1患者死亡的主要原因[5]。鑒于這些有限的治療選擇和 MPNST 的攻擊性行為，需要新的治療方法。通過逃避細胞凋亡來抵抗細胞死亡的能力是腫瘤細胞的一個標志[6]。這種癌細胞特征部分反映了調節內在線粒體凋亡途徑的促凋亡和抗凋亡 BCL-2蛋白之間平衡的失調[7]。BCL-2家族的抗凋亡成員(BCL-2，BCL-xL，BCL-w，MCL-1和 A-1)通過與包埋在線粒體外膜中的多結構域促凋亡成員(BAX 和 BAK)結合來抑制細胞凋亡。許多癌癥過度表達 BCL-2家族的抗凋亡成員，并對死亡刺激具有抗性[8]。與叢狀神經纖維瘤相比，MPNST 表達高水平的 BCL-xL，這被認為與其化耐藥性有關[9]。此外，抑制 BCL-xL 使 NF1衍生的 MPNST 細胞對化敏感[10]。

AT101[(-)-棉酚乙酸]是棉酚的一種改性左旋對映體，棉酚是存在于棉籽中的一種天然多酚醛[11]。盡管自20世紀60年代中期以來，棉酚作為抗腫瘤藥物的使用已被探索[12] ，[13] ，但在2000年代初被發現是 BH3模擬物時，它作為一種可行的抗癌藥物重新受到關注[14]。BH3模擬物與 BCL-2同源結構域3-only (BH3-only)蛋白相似，并與抗凋亡 BCL-2蛋白的 BH3結合溝相互作用，從而阻止其與促凋亡 BCL-2家族蛋白 Bax 和 Bak 的相互作用。先前已經表明，棉酚抑制 BCL-2，BCL-xL 和 MCL-1的抗凋亡功能[15]。有趣的是，棉酚之前也作為一種男性抗生育藥物在臨床試驗中進行了測試[16] ，[17]。棉酚的抗生育作用被認為是由于抑制精原細胞的能量代謝[18] ，而不是其作為 BH3模擬物的作用。其他幾種細胞毒作用模式也歸因于棉酚，包括抑制 DNA 合成和細胞周期停滯[19] ，改變細胞內鈣調節[20] ，抑制蛋白激酶C [21] ，與類固醇受體共激活因子的相互作用[22]和調節線粒體凋亡信號傳導的幾個組分[23]。最近也有證據表明棉酚可以誘導自噬，在某些情況下導致自噬性細胞死亡[24]。鑒于這些多重作用，棉酚誘導任何特定腫瘤類型的細胞死亡的主要機制可能會有所不同，這取決于抗凋亡 BCL-2蛋白和其他腫瘤細胞特異性因子的水平。

本研究的目的是確定 AT101是否在體外對 MPNST 細胞發揮細胞毒作用，并探討其潛在的分子作用機制。我們發現 AT101引起 MPNST 細胞半胱天冬酶非依賴性的非凋亡性細胞死亡，伴隨的自噬不具有細胞保護作用。我們顯示 AT101誘導 BCL-2/E1B-19K 相互作用蛋白3(BNIP3)的表達，BNIP3是一種非典型的僅 BH3蛋白，其促進 AT101誘導的細胞死亡。我們還證明 BNIP3的表達是通過缺氧誘導因子 -1α (HIF-1α)的核內積累來促進的，HIF-1α 可以通過補鐵來消除。我們的研究結果進一步認為 AT101細胞毒性的機制之一是螯合細胞內鐵。抗體和其他試劑

從以下來源獲得一抗: HIF-1α，BECLIN1，BIM，BCL-xL，β-微管蛋白，鐵蛋白 HC 和轉鐵蛋白受體 -1(TfR1/CD71; Santa Cruz Biotechnology Inc. ，Santa Cruz，CA) ; BNIP3(Sigma，St. Louis，MO) ; Lamin A/C (BD TransductionLaboratories，Franklin lake，nJ) ; GAPDH，BCL-2和 PUMA (Cell Signaling，丹弗斯，MA) ; LC3(Abgent，San Diego，CA)。分別從 Biorad (Hercules，CA)和 Cell Signaling (Danvers，MA)獲得辣根過氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗兔和馬抗小鼠抗體。 AT101由 Ascenta Therapeutics (Malvern，PA)提供。BOC- 天冬酰胺(Ome)-氟甲基酮(BAF)和檸檬酸鐵購自 MP Biomedicals (Aurora，OH) ，Bafilomycin A1(BafA1)來自 A.G. Scientific (San Diego，CA)和3-甲基腺嘌呤(3MA) ，星孢菌素(STS) ，甲磺酸去鐵胺(DFO) ，來自 Sigma (St.Louis，MO)的二甲基亞砜(DMSO)。ABT-737購自 TX 休斯敦的塞萊克化工有限公司

Cell CultureWe 先前描述了本研究中使用的人 NF1相關的 MPNST 系 T265-2c 細胞，ST88-14細胞和90-8細胞的來源[25]。這些細胞系的身份按照 ATCC 技術公報8中概述的規范進行例行驗證。簡而言之，細胞的形態和倍增次數是常規評估的，細胞的身份是通過微衛星分析來驗證的。細胞也定期檢測支原體感染。將所有細胞系在含有1% 青霉/鏈霉(Invitrogen，卡爾斯巴德，CA) ，1% L- 氨酰胺(Sigma，St.Louis，MO)和10% 胎牛血清(FBS; Hyclone，Logan，UT)的 DMEM10[ DMEM (Sigma，St.Louis，MO)]中培養，并在37 °C 下在潮濕的5% 二氧化碳，95% 空氣氣氛中溫育。將細胞以20,000/孔的密度鋪在未涂布的48孔板上，并以106個細胞/培養皿的密度鋪在100mm 培養皿中。培養物用于實驗后24小時電鍍。在補充有5% FBS 的培養基中進行藥物治療。細胞活力，Cytotoxicity，細胞凋亡和體外半胱天冬酶切割測定使用 calcein-AM (Life Technologies，卡爾斯巴德，CA)轉化測定來測量細胞活力。使用化學底物 devD-7-氨基 -4-甲基豆素(AMC)(Enzo Life Sciences，Framingdale，NY) ，用體外半胱天冬酶 -3切割測定評估半胱天冬酶活化。這兩種檢測方法均如前所述進行[26]。使用哺乳動物細胞的 LIVE/DEAD 活力/細胞毒性試劑盒和來自分子探針公司公司(Eugene，OR)的 Annexin V Alexa Fluor 488和碘化丙啶的死細胞凋亡試劑盒評估細胞毒性和細胞凋亡。遵循制造商的指示，并使用 BD FACSCalibur 流式細胞儀測量乙錠同型二聚體 -1，Alexa Fluor 488和碘化丙啶的熒光。

 通過去除培養基，用 PBS 洗滌細胞，用細胞提取器刮除細胞，然后通過以3000rpm 離心10分鐘將它們沉淀來制備全細胞裂解物。將細胞沉淀重懸于含有20mM Tris-HCl (pH7.4) ，150mM NaCl，2mM EDTA，1% Triton X-100,10% 甘油，蛋白酶抑制劑混合物(Sigma，St.Louis，MO)和磷酸酶抑制劑雞尾酒1和3(Sigma，St.Louis，MO)。將裂解物澄清并儲存在 -80 °C。30μg 蛋白質按照我們之前描述的方案進行免疫印跡[27]。除 GAPDH 和 LAMIN (1∶5000)外，其余一抗均稀釋至1∶1000。通過增強型化學發光(Pierce ECL; Thermo Scientific，沃爾瑟姆，MA)檢測免疫活性物種。按照制造商的說明，使用 NE-per 提取試劑盒(Thermo Scientific，沃爾瑟姆，MA)提取核和細胞質部分。

一抗在以下工作濃度下使用: LC3(Abgent; 1∶1000) ，BNIP3(Sigma; 1∶100)。HRP 綴合的抗兔超級圖片(Invitrogen; 用于 LC3)和抗小鼠 ImmPRESS (Vector Laboratories; 用于 BNIP3)均以1∶100稀釋使用。使用 Cy3(Perkin-Elmer Life Science Products)的酪胺信號擴增系統檢測免疫反應性。雙苯并酰亞胺(1μg/mL; Hoechst 33258; Sigma)用于核復染。樣品使用裝有 AxioCam 數碼相機的蔡司 Axioskop 熒光顯微鏡進行檢查。使用 Axio Vision Rel 捕獲和分析圖像。4.8軟件(卡爾蔡司顯微成像)。用 RNeasy Plus 微型試劑盒(Qiagen)分離了逆轉錄和實時定量 PCR RNA。隨后使用高容量 cDNA 逆轉錄試劑盒(Applied Biosystems)合成 cDNA。使用 Maxima SYBR Green/ROX qPCR 主混合物(Thermo Scientific，沃爾瑟姆，MA)進行實時定量 PCR 測定，并從 Life Technologies (Carlsbad，CA)獲得探針。在 Stepone Plus 實時 PCR 系統(Applied Biosystems)中進行擴增。從 Harvard PrimerBank 中選擇以下正義/反義引物和探針，用于檢測人 BNIP3(5’-TGAGTCTGGACGGAGTAGCTC-3’和5’-CCCTGTTGGTATCTTGTGGTGT-3’) ，HIF-1α (5’-GAACGTCGAAAAGAAAAGTCTCG-3’和5’-CCTTATCAAGATGCGAACTCACA-3’) 用 ΔΔCT 方法(Livak and Schmittgen，2001)進行分析，并使用 ACTIN RNA 水平作為參考對數值進行調整。

RNAiBNIP3和 HIF-1αsiRNA (siGENOME SMARTPool)購自 Thermo Scientific (Waltham，MA) ，并根據制造商的說明重新構建。將細胞鋪在 DMEM10中，并在鋪板后24小時使用 X-tremeGene siRNA 轉染試劑(Roche，Indianapolis，IN)以5∶2的比例轉染[轉染試劑(μl) : 寡核苷酸(μg)]。第二天，新鮮培養基被添加到細胞中。轉染后48小時復制轉染細胞，轉染后72小時處理。使用來自 Teco Diagnostics (Anaheim，CA)的 Iron/TIBC 試劑組的修改方案，在無細胞系統中評估 AT101，ABT737和 DFO 的鐵結合特性。簡而言之，對測量不飽和鐵結合能力(UIBC)的方案進行了修改，以評估溶液中相應藥物的鐵結合能力。將等體積的 UIBC 緩沖液(Tris 緩沖液0.5 M，pH8.0，表面活性劑和氮化鈉)加入到所有孔中，然后等體積的鐵標準物與試劑盒一起供應，空白除外。不同濃度的 AT101，ABT737和 DFO 被添加到各自的井和體積平衡的無鐵水。在560nm 讀取基線吸光度后，向所有孔中加入等體積的鐵顯色劑(鹽酸羥胺中的 Ferrozine 16.6 mM) ，并將平板在37 °C 溫育10分鐘。孵育后，在560nm 處再次讀取吸光度。根據制造商的說明書計算鐵的含量。