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VectorBuilder矢量輔助線
VectorBuilder整合了數(shù)十年實驗室經(jīng)驗和發(fā)表的研究成果中的矢量學(xué)知識，為我們提供矢量指南。在這里，你可以了解更多關(guān)于基因傳遞各個方面的生物學(xué)、歷史、機(jī)制和應(yīng)用。我們在這里是為了確保您擁有優(yōu)化實驗設(shè)計所需的一切。
規(guī)則質(zhì)?；虮磉_(dá)載體
概述
通過常規(guī)轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒載體遞送到哺乳動物細(xì)胞中是生物醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用廣泛的程序之一。盡管多年來已經(jīng)開發(fā)了許多更復(fù)雜的基因遞送載體系統(tǒng)，如慢病毒載體、腺病毒載體、AAV載體和piggyBac，但傳統(tǒng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染仍然是許多實驗室基因遞送的主力。這在很大程度上是由于其技術(shù)簡單以及在廣泛的電池類型中具有良好的效率。用常規(guī)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的一個關(guān)鍵特征是它是短暫的，只有極低比例的細(xì)胞將質(zhì)粒穩(wěn)定整合在基因組中（通常小于1%）。
關(guān)于這個矢量系統(tǒng)的更多信息，請參閱下面的論文。
參考文獻(xiàn)主題
摩爾生物技術(shù)。16:151（2000）哺乳動物基因表達(dá)載體設(shè)計綜述
EMBO J.12:2539（1993）轉(zhuǎn)錄阻斷劑防止轉(zhuǎn)錄干擾
集錦
我們的載體經(jīng)過優(yōu)化，可在大腸桿菌中進(jìn)行高拷貝數(shù)復(fù)制和高效轉(zhuǎn)染。用載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以基于用戶選擇的標(biāo)記基因表達(dá)來選擇和/或可視化。
優(yōu)勢
技術(shù)簡單性：通過傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒載體輸送到細(xì)胞中在技術(shù)上是簡單的，并且比需要包裝活病毒的基于病毒的載體容易得多。
非常大的貨物空間：我們的載體可以容納約30kb的總DNA。質(zhì)粒骨架僅占約3kb，留下足夠的空間來容納用戶感興趣的序列。
高水平表達(dá)：質(zhì)粒的常規(guī)轉(zhuǎn)染通常會在細(xì)胞中產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)（每個細(xì)胞高達(dá)數(shù)千個拷貝）。這可以導(dǎo)致載體上攜帶的基因具有非常高的表達(dá)水平。
缺點
載體DNA的不整合：質(zhì)粒載體的常規(guī)轉(zhuǎn)染也被稱為瞬時轉(zhuǎn)染，因為載體在沒有整合的細(xì)胞中主要停留為游離體DNA。然而，質(zhì)粒DNA可以以非常低的頻率（根據(jù)細(xì)胞類型，每102至106個細(xì)胞中就有一個）久整合到宿主基因組中。如果將耐藥性或熒光標(biāo)記物摻入質(zhì)粒中，則可以在延長培養(yǎng)后通過藥物選擇或細(xì)胞分選獲得穩(wěn)定整合質(zhì)粒的細(xì)胞。
有限的細(xì)胞類型范圍：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效率因細(xì)胞類型而異。非分裂細(xì)胞通常比分裂細(xì)胞更難轉(zhuǎn)染，原代細(xì)胞通常比永生化細(xì)胞系更難轉(zhuǎn)染。周知，一些重要的細(xì)胞類型，如神經(jīng)元和胰腺β細(xì)胞，很難轉(zhuǎn)染。此外，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染在很大程度上僅限于體外應(yīng)用，很少在體內(nèi)使用。
基因遞送的不均勻性：盡管成功轉(zhuǎn)染會導(dǎo)致每個細(xì)胞的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒載體的平均拷貝數(shù)非常高，但這可能是高度不均勻的。一些細(xì)胞可以攜帶許多拷貝，而另一些細(xì)胞攜帶的拷貝很少或根本沒有。這與基于病毒的載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)不同，后者往往導(dǎo)致相對均勻的基因遞送到細(xì)胞中。
關(guān)鍵組件
啟動子：驅(qū)動你感興趣的基因的啟動子就放在這里。
Kozak：Kozak一致序列。它被放在感興趣的ORF的起始密碼子前面，因為它被認(rèn)為有助于真核生物中的翻譯起始。
ORF：你感興趣的基因的開放閱讀框架放在這里。
SV40晚期pA:Smian病毒40晚期多腺苷酸化信號。它促進(jìn)上游ORF的轉(zhuǎn)錄終止。
巨細(xì)胞病毒啟動子：人類巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子。它驅(qū)動下游標(biāo)記基因的普遍表達(dá)。
標(biāo)記：藥物選擇基因（如霉素耐藥性）、視覺可檢測基因（如EGFP）或雙報告基因（如EGFP/Neo）。這允許用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞被選擇和/或可視化。
BGH pA：牛生長激素多腺苷酸化。它促進(jìn)上游ORF的轉(zhuǎn)錄終止。
pUC ori：復(fù)制的pUC起源。攜帶這種來源的質(zhì)粒在大腸桿菌中以高拷貝數(shù)存在。
氨芐青素：氨芐青素抗性基因。它允許在大腸桿菌中通過選擇氨芐霉素來維持質(zhì)粒。
代表性矢量設(shè)計
VB ID矢量名稱描述
VB010000-9486rey pRP[Exp]-CMV>EGFP/Puro一種編碼由CMV啟動子驅(qū)動的EGFP:嘌呤霉素抗性融合蛋白的常規(guī)質(zhì)粒。
VB900120-0467nuf-pRP[Exp]-CAG>DD-Cre一種編碼不穩(wěn)定的Cre重組酶蛋白的常規(guī)質(zhì)粒，該蛋白在甲芐啶（TMP）存在下，在CAG啟動子的控制下發(fā)揮作用。
精準(zhǔn)遺傳學(xué)：瀏覽Cre-lox工具箱
Cre-Lox系統(tǒng)是基因工程中的一種工具，可以精確控制基因表達(dá)和基因修飾。該系統(tǒng)由兩個主要成分組成：Cre重組酶和loxP位點。在這篇文章中，我們將回顧這兩個主要組件，并深入研究它們是如何每天在實驗室中應(yīng)用的。在對系統(tǒng)進(jìn)行概述后，我們將深入了解系統(tǒng)本身的進(jìn)展，以及如何使用系統(tǒng)來推進(jìn)發(fā)現(xiàn)。
“導(dǎo)致重組"-“交叉位點（x）P1"
Cre重組酶是一種來源于P1噬菌體的酶，在Cre-lox系統(tǒng)中發(fā)揮核心作用。首字母縮寫Cre起初來源于術(shù)語“導(dǎo)致重組"；然而，今天它也被稱為“環(huán)化重組酶"的縮短。這種酶具有識別被稱為loxP位點的特定DNA序列并與之相互作用的特能力。
LoxP位點，簡稱“交叉位點（x）P1"，是由兩個13堿基對的反向和回文重復(fù)序列組成的特異性DNA序列，由一個8堿基對核心序列間隔區(qū)分隔。Cre是一種位點特異性重組酶，它識別13個堿基對的反向重復(fù)序列，核心區(qū)的序列賦予Cre-lox系統(tǒng)方向性。當(dāng)兩個loxP位點面向相反方向放置時，Cre重組酶使兩個位點之間的DNA片段翻轉(zhuǎn)。相反，當(dāng)兩個loxP位點在同一方向上位于DNA片段的兩側(cè)時，Cre重組酶切除位點之間的片段，導(dǎo)致遺傳信息的缺失。在基因組的不同位置面對相同方向的成對loxP位點允許易位（圖1）。
Cre-lox系統(tǒng)的特特性使其能夠應(yīng)用于基因工程中的幾種技術(shù)。Cre-lox系統(tǒng)受歡迎的應(yīng)用之一是用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠。在小鼠中，Cre-lox系統(tǒng)被廣泛用作條件基因操作的工具。研究人員將loxP位點戰(zhàn)略性地放置在靶基因周圍，制造出一種“floxed"基因。然后，在特定啟動子的控制下，用表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠培育這些小鼠，從而實現(xiàn)基因修飾的空間和時間控制（圖2）。當(dāng)Cre在特定組織或某些發(fā)育階段被激活時，它在loxP位點催化重組，導(dǎo)致靶基因的精確改變。這使得有條件的基因敲除、激活或其他修飾成為可能，以可控和動態(tài)的方式深入了解基因功能。小鼠的Cre-lox系統(tǒng)已被證明在理解基因功能、建模疾病和開發(fā)高精度的潛在治療干預(yù)措施方面是非常寶貴的。
例如，腫瘤抑制基因p53的條件敲除模型使研究人員能夠探索其在維持基因組穩(wěn)定性和防止不受控制的細(xì)胞生長方面的作用。通過Cre-lox技術(shù)激活KRAS等致癌基因，可以研究它們對腫瘤發(fā)生和發(fā)展的特定貢獻(xiàn)。PTEN、BRCA1/BRCA2和E-鈣粘蛋白等基因的條件性敲除模型提供了對其在各種癌癥類型（包括乳腺癌、卵巢癌和結(jié)直腸癌）中的作用的深入了解。這些模型通過允許以組織特異性或時間控制的方式靶向操縱特定基因，為揭示癌癥發(fā)展的復(fù)雜分子機(jī)制和在臨床前測試新的治療干預(yù)措施提供了寶貴的工具。
除了在小鼠系中使用外，Cre-lox系統(tǒng)經(jīng)常在體外用于受控的遺傳操作。這種方法使研究人員能夠利用非病毒載體，如含有loxP位點的質(zhì)粒或DNA構(gòu)建體，輕松地引入培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞系。這些loxP側(cè)翼序列可以被工程化以攜帶感興趣的基因、報告基因或其他功能元件。隨后，可以用表達(dá)Cre重組酶的單獨構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)Cre的存在導(dǎo)致loxP位點之間的位點特異性重組，從而產(chǎn)生所需的遺傳修飾。
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